一(yī)，實驗目(mù)的

Ø  學(xué)習(xí)紫外(wài)分光光度法測(cè)定蛋白質含量的(dí)原(yuán)理;

Ø  掌握紫(zǐ)外(wài)分光(guāng)光度法測(cè)定(dìng)蛋(dàn)白(bái)質含量(liáng)的實(shí)驗(yàn)技(jì)術(shù);

Ø  掌握美(měi)析V-1500可見(jiàn)分光(guāng)光(guāng)度計(jì)的使(shǐ)用方法並(bìng)了解此(cǐ)儀(yí)器的主要(yào)構造。

二，實驗(yàn)原(yuán)理(lǐ)

紫外-可(kě)見(jiàn)吸收(shōu)光譜法(fǎ)又稱紫(zǐ)外(wài)-可見(jiàn)分光光(guāng)度法(fǎ),它是研究(jiū)分子(zǐ)吸收190nm～750nm波長(cháng)範圍(wéi)內的(dí)吸收光譜，是以溶液中(zhōng)物質(zhì)分子(zǐ)對光(guāng)的(dí)選(xuǎn)擇性吸收為基(jī)礎而建(jiàn)立(lì)起來的一類分(fēn)析(xī)方法。紫外(wài)-可(kě)見(jiàn)吸收光譜(pǔ)的產生是由(yóu)於(yú)分子的(dí)外層(céng)價電(diàn)子躍(yuè)遷的(dí)結果，其吸收光(guāng)譜為(wéi)分子光譜，是帶(dài)光譜。

進行定性:利用紫外-可見吸收(shōu)光譜法進(jìn)行(háng)定性分(fēn)析一般(bān)采(cǎi)用光譜(pǔ)比較(jiào)法。即(jí)將未(wèi)知純化合(hé)物的(dí)吸收光譜(pǔ)特征，如(rú)吸(xī)收峰(fēng)的數(shù)目，位(wèi)置，相對(duì)強(qiáng)度(dù)以及吸(xī)收峰(fēng)的(dí)形狀(zhuàng)與(yǔ)已知(zhī)純化(huà)合(hé)物的(dí)吸收光譜(pǔ)進行(háng)比較。

定量分析: 紫外-可(kě)見(jiàn)吸收(shōu)光譜法(fǎ)進行定(dìng)量(liáng)分析的依據是朗伯-比(bǐ)爾定律(lǜ)：A=lgI0/I=εbc，當入射光(guāng)波長λ及光(guāng)程(chéng)b一定(dìng)時(shí)，在一(yī)定濃度範(fàn)圍內(nèi)，有(yǒu)色(sè)物質的吸(xī)光度(dù)A與(yǔ)該物質(zhì)的濃度(dù)c成(chéng)正比(bǐ)，即(jí)物(wù)質在一(yī)定波(bō)長處的吸光(guāng)度(dù)與(yǔ)它的濃度成綫形關(guān)係(xì)。因此，通過測定溶(róng)液(yè)對(duì)一定波長(cháng)入(rù)射(shè)光(guāng)的吸光度，就(jiù)可求(qiú)出(chū)溶液中物質濃度和含量(liáng)。由於最大(dà)吸收波長λmax處(chǔ)的摩(mó)爾吸收係數最大，通常(cháng)都(dū)是測量λmax的吸(xī)光度，以獲得(dé)最(zuì)大(dà)靈敏(mǐn)度(dù)。

光(guāng)度分析時，分(fēn)別將(jiāng)空(kōng)白溶液和待測溶液裝(zhuāng)入(rù)厚度為b的兩個吸(xī)收池中(zhōng)，讓一(yī)束(shù)一定波(bō)長的平行單色光(guāng)非別(bié)照(zhào)射空(kōng)白和待(dài)測(cè)溶液，以通過空(kōng)白(bái)溶液(yè)的透光(guāng)強度(dù)為I0，通(tōng)過待測(cè)溶(róng)液的(dí)透光強度(dù)為I，根據(jù)上式，由(yóu)儀器(qì)直接(jiē)給出I0與I之(zhī)比的對數(shù)值(zhí)即(jí)吸光(guāng)度。

紫外-可見分(fēn)光(guāng)光度計:紫外-可見(jiàn)吸(xī)收光(guāng)譜法所(suǒ)采用的儀(yí)器(qì)稱(chēng)為分光光度計(jì)，它的主要部件(jiàn)有五(wǔ)個部(bù)分(fēn)組(zǔ)成，即(jí)

由(yóu)光源發出的復(fù)合光(guāng)經過單(dān)色器(qì)分光後(hòu)即(jí)可獲(huò)得任(rèn)一(yī)所需波長的平(píng)行單色(sè)光,該單色光通(tōng)過(guò)樣品(pǐn)池(chí)靜樣品(pǐn)溶(róng)液吸(xī)收後(hòu)，通過光照(zhào)到光電(diàn)管(guǎn)或光電倍(bèi)增管等檢(jiǎn)測器上產(chǎn)生(shēng)光電(diàn)流(liú)，產生(shēng)的光電(diàn)流由信號(hào)顯(xiǎn)示(shì)器直接讀出吸(xī)光度(dù)A。可(kě)見光區采用(yòng)鎢燈光源，玻(bō)璃(lí)吸收池(chí);紫(zǐ)外光區采(cǎi)用氘燈光源，石英吸收池。

本實驗采用紫(zǐ)外(wài)分光(guāng)光度法測(cè)定蛋白質含(hán)量(liáng)。蛋(dàn)白質(zhì)中(zhōng)酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有(yǒu)共(gòng)軛雙鍵(jiàn)，因(yīn)此(cǐ)，蛋(dàn)白(bái)質(zhì)具有吸(xī)收紫外光的性(xìng)質，其(qí)最大吸收(shōu)峰(fēng)位(wèi)於280 nm附近(jìn)（不(bù)同(tóng)的(dí)蛋白質吸收波長略(lüè)有差別）。在最(zuì)大吸(xī)收(shōu)波長處，吸(xī)光(guāng)度與蛋白質溶(róng)液的濃(nóng)度的關(guān)係(xì)服(fú)從朗伯(bó)-比(bǐ)耳定(dìng)律。該(gāi)測(cè)定法(fǎ)具有簡單(dān)靈敏(mǐn)快(kuài)速高選(xuǎn)擇性，且穩定(dìng)性(xìng)好(hǎo)，幹(gān)擾易(yì)消除不消耗(hào)樣(yàng)品(pǐn)，低濃(nóng)度的鹽類(lèi)不(bù)幹(gān)擾測定(dìng)等優(yōu)點(diǎn)。

特點：帶光譜

分子(zǐ)光譜

應用：定(dìng)性(xìng)分析-最大吸收波長

定(dìng)量(liáng)分(fēn)析(xī)-朗(lǎng)伯(bó)-比爾(ěr)定(dìng)律(lǜ)（標(biāo)準(zhǔn)曲綫法(fǎ)和(hé)標準加(jiā)入法）

根據朗伯－比耳定律：A=εbc，隻要(yào)繪(huì)出以(yǐ)吸光度A為縱(zòng)坐(zuò)標，濃度(dù)c為橫坐標(biāo)的(dí)標準曲綫，測出(chū)試液(yè)的吸光度(dù)，就(jiù)可以(yǐ)由標準(zhǔn)曲綫查得(dé)對應的濃度(dù)值，即未知樣的(dí)含量。

三，儀(yí)器(qì)與試劑(jì)

美析V-1500可見分光(guāng)光度(dù)計(jì)，比色(sè)管，吸(xī)量管(guǎn)

標(biāo)準蛋白(bái)質溶液：5.00 mg.mL-1溶液(yè)

0.9% NaCl溶(róng)液，待測蛋白質溶液(yè)

四(sì)，實(shí)驗步驟

<一(yī)>準備工(gōng)作(zuò)

1. 啟動計算機，打(dǎ)開(kāi)主(zhǔ)機(jī)電源開關(guān)，啟(qǐ)動(dòng)工作站(zhàn)並(bìng)初始化儀(yí)器。

2. 在(zài)工(gōng)作界麵上(shàng)選擇(zé)測(cè)量項(xiàng)目(mù)（光譜掃描，光(guāng)度(dù)測量(liáng)），本實(shí)驗選擇光度(dù)測量，設(shè)置(zhì)測量(liáng)條件(jiàn)（測量(liáng)波(bō)長等）。

3. 將空(kōng)白(bái)放入(rù)測(cè)量(liáng)池(chí)中(zhōng)，點(diǎn)擊(jī)START掃描空白，點擊(jī)ZERO校零。

4. 標準曲綫的製作。

<二(èr)>測量工作(zuò)

1.吸收曲(qū)綫(xiàn)的(dí)繪製(zhì):

用吸量管吸(xī)取(qǔ)2mL5.00mg/mL標準蛋(dàn)白質(zhì)溶(róng)液於(yú)10mL比色管(guǎn)中，用0.9% NaCl溶液(yè)稀(xī)釋至刻 度，搖匀。用1cm石英比色(sè)皿(mǐn)，以(yǐ)0.9% NaCl溶(róng)液為參比(bǐ)，在190 nm～400nm區(qū)間，測量吸光度。

2. 標準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)的製(zhì)作 ：

用(yòng)吸(xī)量管分(fēn)別(bié)吸取(qǔ)0.5，1.0 ，1.5， 2.0 ，2.5  mL 5.00 mg.mL-1標準(zhǔn)蛋(dàn)白(bái)質(zhì)溶液(yè)於5隻(zhī)10 mL 比色(sè)管(guǎn)中，用0.9% NaCl溶液稀釋至(zhì)刻(kè)度(dù)，搖匀(yún)。用(yòng)1 cm石英比(bǐ)色(sè)皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處(chǔ)分別(bié)測定各(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光(guāng)度A278記(jì)錄所(suǒ)得讀數。

3. 樣(yàng)品(pǐn)測定(dìng)：

取適(shì)量濃(nóng)度的待(dài)測(cè)蛋白質(zhì)溶液(yè)3 mL，按(àn)上述方法測定(dìng)278 nm處的(dí)吸光(guāng)度(dù)。平   行測定(dìng)三(sān)份。

五，數據處(chǔ)理(lǐ)：

1. 以(yǐ)波(bō)長為橫(héng)坐標(biāo)，吸光(guāng)度(dù)為縱坐標(biāo)，繪(huì)製吸收(shōu)曲(qū)綫，找(zhǎo)出(chū)最大吸收波長。

由吸(xī)收(shōu)曲(qū)綫可(kě)得(dé)最(zuì)大吸收波長λmax=278nm(圖略)

2. 以(yǐ)標準(zhǔn)蛋白(bái)質(zhì)溶(róng)液濃度(dù)為(wéi)橫坐(zuò)標(biāo)，吸光度為(wéi)縱坐標繪製標(biāo)準曲綫(xiàn)。

濃度C-吸光度A標準(zhǔn)曲綫(xiàn)方(fāng)程(chéng)是：A=0.6208*C+0.0186

曲綫擬合優(yōu)度(dù):   R2=0.9998

3. 根據(jù)樣品蛋白(bái)質溶液(yè)的吸光(guāng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲綫上查(chá)出待(dài)測蛋白質的濃度(dù)。

所測溶(róng)液平均濃度(dù):    C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL

測量的標準偏差(chà)：      =0.003

相對標(biāo)準偏差：       =0.284%

待測蛋(dàn)白(bái)質溶液濃度為(wéi)：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。

六(liù)，思考(kǎo)題:

紫外分光(guāng)光(guāng)度法(fǎ)測定蛋白(bái)質(zhì)含量(liáng)的(dí)方法有(yǒu)何(hé)優(yōu)缺點？受哪(nǎ)些(xiē)因素(sù)的影響和限(xiàn)製？

優點(diǎn)：該測(cè)定(dìng)法具有簡(jiǎn)單靈敏快速高(gāo)選(xuǎn)擇(zé)性(xìng)，且穩定性好(hǎo)，幹擾易消除(chú)不消耗(hào)樣(yàng)品(pǐn)，低(dī)濃度的(dí)鹽類不幹(gān)擾測定(dìng)等優(yōu)點(diǎn)。

缺點：儀器昂貴，而且(qiě)不(bù)同(tóng)的蛋(dàn)白(bái)質的(dí)紫外吸(xī)收(shōu)是不相同(tóng)的(dí)，測定結(jié)果(guǒ)存在著一(yī)定(dìng)的(dí)誤(wù)差。

七(qī)，注意(yì)事項:

1.繪(huì)製(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲綫時(shí)，蛋(dàn)白(bái)質溶(róng)液濃度(dù)要準(zhǔn)確配製(zhì)，作為標準溶液;

2.測(cè)量(liáng)吸光度(dù)時(shí)，比(bǐ)色皿(mǐn)要保(bǎo)持(chí)潔(jié)淨，切勿用手玷汙(wū)其(qí)光麵;

3.石(shí)英比(bǐ)色皿比較貴(guì)重，使用(yòng)時(shí)要(yào)小心。